مقدمه
بیماری های ویروسی به عنوان مهم ترین علل خسارات اقتصادی به صنعت پرورش طیور به شمار میروند. از بین آنها ، بیماری آنفلوانزا علاوه بر خسارت اقتصادی ، از نظر بهداشت انسانی نیز اهمیت دارد . اولین پاندمی انسانی توسط تحت تیپ (H1N1) درسال 1918 بیش از جمعیت انسانی را مبتلا کرد و میلیون های نفر را از بین برد . هر چند وقوع انسانی بیماری آنفلوانزای طیور ناشی از تحت تیپ (H5N1) در جنوب شرقی آسیا به ندرت باعث وقوع بیماری در انسان گردید ، با وجود این انتقال بیماری آنفلوانزای طیور تحت تیپ (H5N1) از انسان به انسان ، در موارد نادری به ثبت رسیده است .
برای وقوع پاندمی در انسان سه شرط لازم است ؛ ویروس جدیدی از آنفلوانزا ظهورمی نماید که مردم نسبت به آن ایمنی نداشته باشند ؛ توانایی انتقال به انسان و ایجاد بیماری را داشته باشد ؛ توانایی انتقال انسان به انسان را کسب نماید . در مورد تحت تیپ (H5N1) ، دو شرط اولیه برای ایجاد پاندمی فراهم شده است . در صورت تغییر مختصر در آن و ایجاد ویروس جدید و کسب توانایی انتقال از انسان به انسان پاندمی بروز می نماید. انتشار سریع آنفلوآنزای آسیایی سویه از سال 2003و ثبت مدارکی مبنی بر انتقال آن از گونه های طیور به انسان و سایر پستانداران توجه جهانی به سمت روشهای تشخیص ویروس آنفلوآنزا سوق پیدا نمود . همزمان با روشهای سنتی متداول تشخیص این ویروس ، تکنیک های جدید به وفوری جهت بررسی و تشخیص ویروس آنفلوآنزا در سراسر جهان به سرعت ابداع گردید . در این بین روشهای مولکولی پیشرفت قابل توجهی نمود و تکنیک های جامعی را بوجود آورد که با استفاده از آن می توان در یک روز علاوه بر تشخیص ویروس پاتوتیپ آن را تمیین نمود و نیز مشخصات فیلوژنتیکی ویروس A آنفلوآنزا جداسازی شده از نمونه های کلینیکی را مورد ارزیابی قرار داد.
تشخیص کلینیکی آنفلوآنزای طیور بسیار پیچیده می باشد زیرا این ویروس ضایعات پاتوگونومیک از لحاظ بالینی و میکروسکوپی ایجاد نمی کند . بخصوص در پرندگان آبزی که مخازن عمده این ویروس هستند عفونت بدون وجود علائم خاص می باشد . این پرندگان به عنوان حامل می توانند باعث دفع ویروس شوند که ضایعات شدیدی را در طیور اهلی ایجاد می نماید در طیور اهلی میزان ضایعات پاتولوژیک بر حسب تحت تیپ و پاتوتیپ ، گونه میزبان و حضور عفونت های ثانویه ، تفاوت می کند.
جمع آوری نمونه ها و ذخیره سازی
ویروسهای آنفلوانزای طیور عموماً از سوآپ های نای ، محوطه دهانی ، حلقی یا سوآپ های کلوآک از پرندگان زنده یا مرده جدا می گردد زیرا اغلب ویروسهای حاد و غیر حاد در مجاری تنفسی و گوارشی تکثیر می یابند . این سرآپ ها باید در یک محیط استریل که حاوی سطوح بالایی از آنتی بیوتیک برای جلوگیری از رشد باکتریایی است ، قرار داده شود. بافتها ، ترشحات یا مواد دفعی این مجاری برای جداسازی و تشخیص ویروس مناسب می باشند بافت ها را می توان در کیسه های پلاستیکی استریل قرار داد . در هنگام آزمایش بافت باید به این نکته دقت نمود که اندام های داخلی باید جدا از بافتهای مجاری تنفسی و گوارشی بررسی گردد زیرا جداسازی ویروس از اندام های داخلی عموماً نشاندهنده انتشار سیستمیک ویروس است و اغلب با ویروسهای حاد (HPAI) ارتباط دارد . در موارد HPAI تمام اندام ها به علت انتشار وسیع ویروسی ، حاوی ویروس هستند. اگر نمونه ها درعرض 48 ساعت قابل آزمایش هستند می توان آنها را در 4 درجه سانتیگراد نگهداری کرد ولی اگر بیش از این طول بکشد توصیه می شود که نمونه ها در نگهداری گردد . قبل از آزمایش ویروس شناسی بافت ها باید در یک محیط انتقالی به صورت سوسپانسیون 5 تا 10% درآمده و سپس با سرعت پایین سانتریفوژ گردد (Swayne and Hatvorson 2008).
1-مکانیسم های حدت ویروس
ویروس های آنفلوانزای طیور ممکن است بر اساس شدت نشانه های بالینی که در پرندگان حساس ایجاد می نمایند ، دسته بندی شوند.آنفلوانزای طیور با بیماری زایی کم ممکن است به وسیله 16 تیپ هماگلوتینین ایجاد شوند و در پرندگان حساس بیماری خفیف تولید نمایند ، که به وسیله ی نشانه های گوارشی ، تنفسی مشخص می شود و اغلب در مرغ های تخم گذار تجارتی و مرغ های مادر این نشانه ها با اختلالات تولید همراه است . گاهی ویروس های ( LPAI) اصطلاحاً ویروس های آنفلوانزای طیور با بیماری زایی ملایم (MPAI) نامیده می شوند . بر عکس ، آنفلوانزای طیور با بیماری زایی بالا یک بیماری عمومی ویروسی با تلفات بالا است که در بسیاری از پرندگان گالیناسه تلفات نزدیک به 100 درصد ایجاد می کند به هر حال ، این دو بیماری با یکدیگر ارتباط دارند. شواهد جمع آوری شده از موارد همه گیری های اخیر نشان داد که ویروس های (LPAI) تیپ های ( ) و ( ) ممکن است مدتی بعد از ورود به گله های طیور اهلی ، جهش یابند و تبدیل به (HPAI ) شوند ، علاوه بر این جهش ویروس های (LPAI) تحت تیپ ( ) به ویروس های (HPAI) در آزمایشگاه نیزایجاد شده است . نشانه های بالینی (HPAI) فقط به وسیله ی تحت تیپ های ( ) و ( ) که دارای اسیدهای آمینه بازی متعدد در محل شکاف مولکول پیش ساز هماگلوتینین باشند ، ایجاد می شود . شکاف مولکولی پیش ساز هماگلوتینین برای عفونی زایی ذرات ویروس آنفلوانزای طیور لازم و ضروری می باشد و تعداد اسیدهای آمینه بازی موجود در محل شکافتگی ، انواع آنزیم های میزبانی موثر در این محل را تعیین می کند .در حقیقت وجود اسیدهای آمینه ی بازی متعدد اجازه می دهد که هماگلوتینین به وسیله ی پروتئازهای عمومی و فراوان موجود در بافت های میزبان شکافته شود . بنابراین ویروس در همه ی قسمت های بدن میزبان از جمله اندام های حیاتی تکثیر و منجر به مرگ پرنده می شود . برعکس ، ویروس های (LPAI) ، اسیدهای امینه بازی متعددی در محل شکافتگی هماگلوتینین ندارند و این ویژگی ، شکستن مولکول پیش ساز هماگلوتینین را محدود به آنزیم های شبه تریپسینی می کند. بنابراین ویروس های (LPAI) تنها در محل هایی که آنزیم های تریپسین و شبه تریپسین دارند ، یعنی در اپی تلیوم روده و بافت پوششی دستگه تنفس تکثیر می یابند .پرندگان آبزی از این فرضیه مستثنی هستند ، این پرندگان علاوه بر این که به عنوان منبع ویروس های (LPAI) عمل می کنند ، نسبت به ویروس (HPAI) مقاوم هستند و نشانه های بالینی را نشان نمی دهند(ترجمه میاحی وجعفری. 1386 ) .
روشهای تشخیص ویروس آنفلوآنزا
تکنیک های تشخیص مستقیم
جداسازی ویروس
اثبات وجود ویروس با تلقیح ویروس در تخم مرغ جنین دار به عنوان روش استاندارد طلایی تشخیص ویروس AI از نظر تاریخی شناخته شده است . ویروس به درون کیسه کوریو آلانتوئیک و در بعضی مواقع به داخل کیسه زرده و غشاء کوریو آلانتوئیک تلقیح می شود. سپس به مدت 24 تا 48 ساعت برای سویه های HPAI و حداکثر به مدت 21 روز با 2 یا 3 پاساژ برای بعضی از سویه های LPAI انکوبه می شوند (Chariton B, et al .,2008)
جنین ماکیان 11-9 روزه با 2/0 میلی لیتر از نمونه مشکوک به درون کیسه آلانتوئیک یا کیسه زرده تلقیح می شود . بعد از 72 ساعت (بسته به سویه ویروس ) تخم مرغ یا جنین مرده از آنکوباتور برداشته شده و مایع آلانتوئیک جمع آوری می شود . وجود ویروس بوسیله فعالیت هماگلوتینین اثبات می گردد. ولی باید حضور ویروس نیوکاسل را نیز مدنظر قرار داد . معمولاً اگر ویروس وجود داشته باشد در اولین پاساژ هماگلوتیناسیون رخ خواهد داد و نیاز به پاساژ مجدد نیست ((Swayne and Hatvorson 2008)
مایع آلانتوئیک از نظر وجود هماگلوتیناسیون برای شناسایی ویروس استفاده می شود . اما به این نکته باید توجه نمود که سایر ویروسهای دارای خاصیت هماگلوتینین مثل پارامیکسو ویروسها ممکن است باعث مثبت شده آزمایش گردند. بنابراین ابتدا باید ویروس با روش HI علیه ویروس نیوکاسل و سایر ویروسهای مشابه تست شود اگر منفی بود این ویروس باید از لحاظ وجود آنتی ژن اختصاصی تیپ A آنفلوآنزا مورد ارزیابی قرار گیرد . نوکلئوپروتئین اختصاص تیپ NP یا پروتئین ماتریکس (M) را می توان بوسیله ایمونودیفیوژن دو طرفه یا تثبیت Ag با روشهای ایمنی مورد آزمایش قرار داد( Swayne and Hatvorson 2008).
منوکلونال آنتی بادی که با نوکلئوپروتئین یا پروتئین ماتریکس واکنش نشان میدهد در روش الیزا برای این هدف بکار برده می شود .
مرحله بعد ، تشخیص تحت تیپ های آنتی ژن های سطحی HA و NA می باشد . تحت تیپ های NA بوسیله روشهای میکرو NI(Micro –NI assay) با آنتی سرم هایی که علیه 9 سویه شناخته شده NA تهیه شده ، شناسایی می گردد . آنتی ژن HA بوسیله آزمایش HIتشخیص داده می شود در این هدف بوسیله یک آنتی سرم پلی کلونال تهیه شده علیه تمام ویروسهایی که 16 تحت تیپ HA را بروز می دهند صورت می گیرد . شناسایی این تحت تیپ ها بوسیله بکاربردن آنتی سرم اختصاصی علیه یکایک HA به صورت مجزا صورت می گیرد . ظهورویروس آنفلوآنزا با HA جدید قابل شناسایی باتحت تیپ های HA شناخته شده نیست .بنابراین برای تایید عامل هماگلوتینین ناشناخته نیاز به آزمایش تشخیص اختصاص تیپ می باشد که قبلاً توضیح داده شد. تشخیص نهایی عمدتاً توسط آزمایش مرکزی فدرال یا آزمایشگاه رفرانس OIE آنفلوآنزا صورت می گیرد (( Swayne and Hatvorson 2008)
تسخیر Ag ویروسی در روش ELISA
روشهای الیزا که در آن Ag ویروس را جذب می کنند روشی جهانی برای تشخیص سریع آنفلوآنزا گروه A میباشد در این روشها ویروس آنفلوآنزا یا آنتی ژن های ویروسی با بکاربردن منوکلونال آنتی بادی اختصاص نوکلوپروتئین یا آنتی بادی پلی کلونال که در یک ماتریکس جامد باند شده است انجام می گیرد . سپس ویروس آنفلوآنزا A در نمونه های کلینیک ، سوآپ های کلواک یا بافتها توسط یک آنتی بادی ثانویه متصل شده به ماده رنگ زا مورد شناسایی قرار می گیرد .
همچنین تسخیر Ag ها در محل هماگلوتینین در تشخیص ویروس آنفلوآنزا H5 بکار گرفته شده است . این گونه روشهای الیزا از لحاظ تکنیکی ساده بوده و تنها چند دقیقه وقت برای آزمایش نیاز دارند اگر چه از یک سازنده تا سازندگان دیگر روش الیزا تفاوت هایی وجود دارد .
محدودیت تشخیص برای اکثر روشهای الیزای تجارتی ، 1000 برابر کمتر از جداسازی ویروس می باشد و به طور معمول نیاز به تا ذره ویروس برای شناسایی نیاز دارد . روشهای الیزا زمانی مناسب هستند که خطر بالایی از بروز عفونت فعال آنفلوآنزا وجود دارد و انتشار ویروس شدت بالایی داشته نیاز به آزمایشات تکمیلی باشد ولی در سطوح پایین انتشار ویروس و یا زمان کوتاه دفع ویروس درحدود2 تا 5 روز ، این نوع روشهای الیزا حساسیت لازم و قابل اعتماد جهت تشخیص شیوع بیماری را ندارند (Chariton B, et al .,2008) .
بیماری های ویروسی به عنوان مهم ترین علل خسارات اقتصادی به صنعت پرورش طیور به شمار میروند. از بین آنها ، بیماری آنفلوانزا علاوه بر خسارت اقتصادی ، از نظر بهداشت انسانی نیز اهمیت دارد . اولین پاندمی انسانی توسط تحت تیپ (H1N1) درسال 1918 بیش از جمعیت انسانی را مبتلا کرد و میلیون های نفر را از بین برد . هر چند وقوع انسانی بیماری آنفلوانزای طیور ناشی از تحت تیپ (H5N1) در جنوب شرقی آسیا به ندرت باعث وقوع بیماری در انسان گردید ، با وجود این انتقال بیماری آنفلوانزای طیور تحت تیپ (H5N1) از انسان به انسان ، در موارد نادری به ثبت رسیده است .
برای وقوع پاندمی در انسان سه شرط لازم است ؛ ویروس جدیدی از آنفلوانزا ظهورمی نماید که مردم نسبت به آن ایمنی نداشته باشند ؛ توانایی انتقال به انسان و ایجاد بیماری را داشته باشد ؛ توانایی انتقال انسان به انسان را کسب نماید . در مورد تحت تیپ (H5N1) ، دو شرط اولیه برای ایجاد پاندمی فراهم شده است . در صورت تغییر مختصر در آن و ایجاد ویروس جدید و کسب توانایی انتقال از انسان به انسان پاندمی بروز می نماید. انتشار سریع آنفلوآنزای آسیایی سویه از سال 2003و ثبت مدارکی مبنی بر انتقال آن از گونه های طیور به انسان و سایر پستانداران توجه جهانی به سمت روشهای تشخیص ویروس آنفلوآنزا سوق پیدا نمود . همزمان با روشهای سنتی متداول تشخیص این ویروس ، تکنیک های جدید به وفوری جهت بررسی و تشخیص ویروس آنفلوآنزا در سراسر جهان به سرعت ابداع گردید . در این بین روشهای مولکولی پیشرفت قابل توجهی نمود و تکنیک های جامعی را بوجود آورد که با استفاده از آن می توان در یک روز علاوه بر تشخیص ویروس پاتوتیپ آن را تمیین نمود و نیز مشخصات فیلوژنتیکی ویروس A آنفلوآنزا جداسازی شده از نمونه های کلینیکی را مورد ارزیابی قرار داد.
تشخیص کلینیکی آنفلوآنزای طیور بسیار پیچیده می باشد زیرا این ویروس ضایعات پاتوگونومیک از لحاظ بالینی و میکروسکوپی ایجاد نمی کند . بخصوص در پرندگان آبزی که مخازن عمده این ویروس هستند عفونت بدون وجود علائم خاص می باشد . این پرندگان به عنوان حامل می توانند باعث دفع ویروس شوند که ضایعات شدیدی را در طیور اهلی ایجاد می نماید در طیور اهلی میزان ضایعات پاتولوژیک بر حسب تحت تیپ و پاتوتیپ ، گونه میزبان و حضور عفونت های ثانویه ، تفاوت می کند.
جمع آوری نمونه ها و ذخیره سازی
ویروسهای آنفلوانزای طیور عموماً از سوآپ های نای ، محوطه دهانی ، حلقی یا سوآپ های کلوآک از پرندگان زنده یا مرده جدا می گردد زیرا اغلب ویروسهای حاد و غیر حاد در مجاری تنفسی و گوارشی تکثیر می یابند . این سرآپ ها باید در یک محیط استریل که حاوی سطوح بالایی از آنتی بیوتیک برای جلوگیری از رشد باکتریایی است ، قرار داده شود. بافتها ، ترشحات یا مواد دفعی این مجاری برای جداسازی و تشخیص ویروس مناسب می باشند بافت ها را می توان در کیسه های پلاستیکی استریل قرار داد . در هنگام آزمایش بافت باید به این نکته دقت نمود که اندام های داخلی باید جدا از بافتهای مجاری تنفسی و گوارشی بررسی گردد زیرا جداسازی ویروس از اندام های داخلی عموماً نشاندهنده انتشار سیستمیک ویروس است و اغلب با ویروسهای حاد (HPAI) ارتباط دارد . در موارد HPAI تمام اندام ها به علت انتشار وسیع ویروسی ، حاوی ویروس هستند. اگر نمونه ها درعرض 48 ساعت قابل آزمایش هستند می توان آنها را در 4 درجه سانتیگراد نگهداری کرد ولی اگر بیش از این طول بکشد توصیه می شود که نمونه ها در نگهداری گردد . قبل از آزمایش ویروس شناسی بافت ها باید در یک محیط انتقالی به صورت سوسپانسیون 5 تا 10% درآمده و سپس با سرعت پایین سانتریفوژ گردد (Swayne and Hatvorson 2008).
1-مکانیسم های حدت ویروس
ویروس های آنفلوانزای طیور ممکن است بر اساس شدت نشانه های بالینی که در پرندگان حساس ایجاد می نمایند ، دسته بندی شوند.آنفلوانزای طیور با بیماری زایی کم ممکن است به وسیله 16 تیپ هماگلوتینین ایجاد شوند و در پرندگان حساس بیماری خفیف تولید نمایند ، که به وسیله ی نشانه های گوارشی ، تنفسی مشخص می شود و اغلب در مرغ های تخم گذار تجارتی و مرغ های مادر این نشانه ها با اختلالات تولید همراه است . گاهی ویروس های ( LPAI) اصطلاحاً ویروس های آنفلوانزای طیور با بیماری زایی ملایم (MPAI) نامیده می شوند . بر عکس ، آنفلوانزای طیور با بیماری زایی بالا یک بیماری عمومی ویروسی با تلفات بالا است که در بسیاری از پرندگان گالیناسه تلفات نزدیک به 100 درصد ایجاد می کند به هر حال ، این دو بیماری با یکدیگر ارتباط دارند. شواهد جمع آوری شده از موارد همه گیری های اخیر نشان داد که ویروس های (LPAI) تیپ های ( ) و ( ) ممکن است مدتی بعد از ورود به گله های طیور اهلی ، جهش یابند و تبدیل به (HPAI ) شوند ، علاوه بر این جهش ویروس های (LPAI) تحت تیپ ( ) به ویروس های (HPAI) در آزمایشگاه نیزایجاد شده است . نشانه های بالینی (HPAI) فقط به وسیله ی تحت تیپ های ( ) و ( ) که دارای اسیدهای آمینه بازی متعدد در محل شکاف مولکول پیش ساز هماگلوتینین باشند ، ایجاد می شود . شکاف مولکولی پیش ساز هماگلوتینین برای عفونی زایی ذرات ویروس آنفلوانزای طیور لازم و ضروری می باشد و تعداد اسیدهای آمینه بازی موجود در محل شکافتگی ، انواع آنزیم های میزبانی موثر در این محل را تعیین می کند .در حقیقت وجود اسیدهای آمینه ی بازی متعدد اجازه می دهد که هماگلوتینین به وسیله ی پروتئازهای عمومی و فراوان موجود در بافت های میزبان شکافته شود . بنابراین ویروس در همه ی قسمت های بدن میزبان از جمله اندام های حیاتی تکثیر و منجر به مرگ پرنده می شود . برعکس ، ویروس های (LPAI) ، اسیدهای امینه بازی متعددی در محل شکافتگی هماگلوتینین ندارند و این ویژگی ، شکستن مولکول پیش ساز هماگلوتینین را محدود به آنزیم های شبه تریپسینی می کند. بنابراین ویروس های (LPAI) تنها در محل هایی که آنزیم های تریپسین و شبه تریپسین دارند ، یعنی در اپی تلیوم روده و بافت پوششی دستگه تنفس تکثیر می یابند .پرندگان آبزی از این فرضیه مستثنی هستند ، این پرندگان علاوه بر این که به عنوان منبع ویروس های (LPAI) عمل می کنند ، نسبت به ویروس (HPAI) مقاوم هستند و نشانه های بالینی را نشان نمی دهند(ترجمه میاحی وجعفری. 1386 ) .
روشهای تشخیص ویروس آنفلوآنزا
تکنیک های تشخیص مستقیم
جداسازی ویروس
اثبات وجود ویروس با تلقیح ویروس در تخم مرغ جنین دار به عنوان روش استاندارد طلایی تشخیص ویروس AI از نظر تاریخی شناخته شده است . ویروس به درون کیسه کوریو آلانتوئیک و در بعضی مواقع به داخل کیسه زرده و غشاء کوریو آلانتوئیک تلقیح می شود. سپس به مدت 24 تا 48 ساعت برای سویه های HPAI و حداکثر به مدت 21 روز با 2 یا 3 پاساژ برای بعضی از سویه های LPAI انکوبه می شوند (Chariton B, et al .,2008)
جنین ماکیان 11-9 روزه با 2/0 میلی لیتر از نمونه مشکوک به درون کیسه آلانتوئیک یا کیسه زرده تلقیح می شود . بعد از 72 ساعت (بسته به سویه ویروس ) تخم مرغ یا جنین مرده از آنکوباتور برداشته شده و مایع آلانتوئیک جمع آوری می شود . وجود ویروس بوسیله فعالیت هماگلوتینین اثبات می گردد. ولی باید حضور ویروس نیوکاسل را نیز مدنظر قرار داد . معمولاً اگر ویروس وجود داشته باشد در اولین پاساژ هماگلوتیناسیون رخ خواهد داد و نیاز به پاساژ مجدد نیست ((Swayne and Hatvorson 2008)
مایع آلانتوئیک از نظر وجود هماگلوتیناسیون برای شناسایی ویروس استفاده می شود . اما به این نکته باید توجه نمود که سایر ویروسهای دارای خاصیت هماگلوتینین مثل پارامیکسو ویروسها ممکن است باعث مثبت شده آزمایش گردند. بنابراین ابتدا باید ویروس با روش HI علیه ویروس نیوکاسل و سایر ویروسهای مشابه تست شود اگر منفی بود این ویروس باید از لحاظ وجود آنتی ژن اختصاصی تیپ A آنفلوآنزا مورد ارزیابی قرار گیرد . نوکلئوپروتئین اختصاص تیپ NP یا پروتئین ماتریکس (M) را می توان بوسیله ایمونودیفیوژن دو طرفه یا تثبیت Ag با روشهای ایمنی مورد آزمایش قرار داد( Swayne and Hatvorson 2008).
منوکلونال آنتی بادی که با نوکلئوپروتئین یا پروتئین ماتریکس واکنش نشان میدهد در روش الیزا برای این هدف بکار برده می شود .
مرحله بعد ، تشخیص تحت تیپ های آنتی ژن های سطحی HA و NA می باشد . تحت تیپ های NA بوسیله روشهای میکرو NI(Micro –NI assay) با آنتی سرم هایی که علیه 9 سویه شناخته شده NA تهیه شده ، شناسایی می گردد . آنتی ژن HA بوسیله آزمایش HIتشخیص داده می شود در این هدف بوسیله یک آنتی سرم پلی کلونال تهیه شده علیه تمام ویروسهایی که 16 تحت تیپ HA را بروز می دهند صورت می گیرد . شناسایی این تحت تیپ ها بوسیله بکاربردن آنتی سرم اختصاصی علیه یکایک HA به صورت مجزا صورت می گیرد . ظهورویروس آنفلوآنزا با HA جدید قابل شناسایی باتحت تیپ های HA شناخته شده نیست .بنابراین برای تایید عامل هماگلوتینین ناشناخته نیاز به آزمایش تشخیص اختصاص تیپ می باشد که قبلاً توضیح داده شد. تشخیص نهایی عمدتاً توسط آزمایش مرکزی فدرال یا آزمایشگاه رفرانس OIE آنفلوآنزا صورت می گیرد (( Swayne and Hatvorson 2008)
تسخیر Ag ویروسی در روش ELISA
روشهای الیزا که در آن Ag ویروس را جذب می کنند روشی جهانی برای تشخیص سریع آنفلوآنزا گروه A میباشد در این روشها ویروس آنفلوآنزا یا آنتی ژن های ویروسی با بکاربردن منوکلونال آنتی بادی اختصاص نوکلوپروتئین یا آنتی بادی پلی کلونال که در یک ماتریکس جامد باند شده است انجام می گیرد . سپس ویروس آنفلوآنزا A در نمونه های کلینیک ، سوآپ های کلواک یا بافتها توسط یک آنتی بادی ثانویه متصل شده به ماده رنگ زا مورد شناسایی قرار می گیرد .
همچنین تسخیر Ag ها در محل هماگلوتینین در تشخیص ویروس آنفلوآنزا H5 بکار گرفته شده است . این گونه روشهای الیزا از لحاظ تکنیکی ساده بوده و تنها چند دقیقه وقت برای آزمایش نیاز دارند اگر چه از یک سازنده تا سازندگان دیگر روش الیزا تفاوت هایی وجود دارد .
محدودیت تشخیص برای اکثر روشهای الیزای تجارتی ، 1000 برابر کمتر از جداسازی ویروس می باشد و به طور معمول نیاز به تا ذره ویروس برای شناسایی نیاز دارد . روشهای الیزا زمانی مناسب هستند که خطر بالایی از بروز عفونت فعال آنفلوآنزا وجود دارد و انتشار ویروس شدت بالایی داشته نیاز به آزمایشات تکمیلی باشد ولی در سطوح پایین انتشار ویروس و یا زمان کوتاه دفع ویروس درحدود2 تا 5 روز ، این نوع روشهای الیزا حساسیت لازم و قابل اعتماد جهت تشخیص شیوع بیماری را ندارند (Chariton B, et al .,2008) .